TU Wien | Nanoskopie Wenn Bilder trügen

Ein typisches Bild, zusammengesetzt aus mehreren Mikroskop-Aufnahmen.
Ein typisches Bild, zusammengesetzt aus mehreren Mikroskop-Aufnahmen.

Der Schein trügt - auch bei Molekülen. Immer wieder wird beobachtet, wie sich Membranproteine zu Clustern zusammenballen. Dabei handelt es sich oft lediglich um eine Mehrfachzählung von blinkenden Molekülen. Die TU Wien hat ein Verfahren entwickelt, um Cluster und »Mehrfachblinker« zu unterscheiden.

Für einige Jahrzehnte war es nicht möglich mit Licht Strukturen abzubilden, die kleiner sind als die halbe Wellenlänge. Die Entwicklung der ultrahochauflösenden Fluoreszenz-Mikroskopie – auch Nanoskopie genannt – zeigt jedoch, dass diese Auflösungsgrenze unterschritten werden kann. Lässt man unterschiedliche Moleküle zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufleuchten, können sie am Ende zu einem scharfen Bild zusammengefügt werden. Für die Entwicklung dieses Verfahrens erhielten der deutsche Biophysiker Stefan W. Hell und die Physiker Eric Betzik und William E. Moerner 2014 den Chemie-Nobelpreis. Inzwischen ist die Nanoskopie eine weltweit angewandte Methode, mit der unter anderem die Struktur der Zellmembran untersucht wird.

Bei Versuchen beobachteten Forscher immer wieder, dass sich scheinbar Membranproteine in Gruppen zusammenballen. Auch an der TU Wien untersuchte man diese Cluster. Dabei wurde erkannt, dass es sich bei vermeintlichen Gruppen von Proteinen oftmals um einzelne blinkende Moleküle handelt, die mehrfach gezählt werden. Die neue Methode der TU Wien kann nun zwischen echten Clustern und solchen Artefakten unterscheiden.

»Für viele biologische oder medizinische Fragestellungen ist es entscheidend, die Struktur der Zellmembran genau zu verstehen«, erläutert Florian Baumgart von der Biophysik-Forschungsgruppe um Gerhard Schütz am Institut für Angewandte Physik der TU Wien. Nanoskopie sei ein ideales Werkzeug, um die räumliche Anordnung von Proteinen auf der Zellmembran zu untersuchen. Die Biophysiker forschen an T-Zellen, die Antigene erkennen und dadurch eine zentrale Rolle im menschlichen Immunsystem spielen.

Um Nanoskopie auf biologische Proben anzuwenden, werden Proteine mit fluoreszierenden Molekülen (sogenannten Fluorophoren) markiert. In der klassischen Fluoreszenzmikroskopie ist ein einzelner Fluorophor nicht als klarer Punkt, sondern als leicht verschwommene Scheibe sichtbar. Leuchten alle Moleküle der Probe gleichzeitig, überlappen ihre Abbildungen und die Information über ihre räumliche Anordnung gehen verloren. Über einen chemischen Trick kann die Fluorophore allerdings zum Blinken gebracht werde. Es wird eine Serie von Bildern aufgenommen, wobei immer nur einige wenige Fluorophore aufleuchten. Am Computer kann die Position der Moleküle in jedem Einzelbild bestimmt und daraus schließlich ein hochaufgelöstes Bild der Probe rekonstruieren werden.

T-Zellen – auch T-Lymphozyten – bilden eine Gruppe von weißen Blutzellen aus, die zur Immunabwehr dienen. Sie können bei der Antigenerkennung in kurzer Zeit stabile Proteincluster bilden, die so groß sind, dass man sie sogar mit klassischer Fluoreszenzmikrokopie nachweisen kann. Nanoskopisch kleine Proteincluster könnten Vorläufer dieser größeren Strukturen sein. Auch Baumgart machte sich auf die Suche nach solchen Nanoclustern. Aber Nanoskopie ist eben nicht so einfach. Es gibt viele Fehlerquellen und man muss die gewonnenen Daten sorgfältig auswerten, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Außerdem leuchten manche Moleküle wiederholt auf. Es ist nur zu leicht die mehrfachen Lichtsignale als Molekülcluster zu interpretieren – was allerdings nicht zutreffend ist.

Um Cluster von abwechselnd leuchtenden Molekülen von einem einzigen, immer wieder blinkenden Molekül zu unterscheiden, wurde die Konzentration der zur Markierung verwendeten Fluorophore schrittweise verändert. »In den aufgenommen Bildern können zufällig verteilte Moleküle mehrfach abgebildet werden, oder es kann sich tatsächlich um Clusterbildung handeln«, erläutert Baumgart. Versammeln sich die Proteine tatsächlich in Clustern, dann werden dort zwar mehr Molekülpositionen sichtbar, aber dazwischen bleiben dunkle Freiräume. Handelt es sich allerdings um einzelne, mehrfach aufleuchtende Moleküle, dann wird bei steigender Konzentration fluoreszierender Moleküle die gesamte Fläche der Probe mit Molekülpositionen aufgefüllt ohne sich lokal massiv zu häufen.

Die Methode, mit der man Proteincluster von mehrfach blinkenden Molekülen unterscheiden kann, wurde nun im Fachjournal »Nature Methods« publiziert. Sie soll in Zukunft helfen, Bilder aus der Nanoskopie richtig zu deuten und die großen Rätsel der Zellmembran aufzuklären.