Chemie-Nobelpreis 2014 Unterhalb des Abbéschen Beugungslimits

Prinzip des STED-Mikroskops. Die Probe wird gleichzeitig von zwei Lasern beleuchtet; einer regt die Moleküle zur Fluoreszenz an, der Lichtimpuls des zweiten beschränkt das fluoreszierende Volumen auf nur wenige Nanometer (1). Durch das Abscannen der Probe (2) entsteht ein Bild mit einer Auflösung im Nanometer-Bereich.

Seit 1873 galt die Erkenntnis von Ernst Abbé, dass die Auflösung eines Mikroskops begrenzt ist durch die Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle. Der diesjährige Nobelpreis in Chemie geht an drei Wissenschaftler, die das Phänomen der Fluoreszenz genutzt haben, um das Beugungslimit zu umgehen.

Die Königlich-Schwedische Akademie der Wissenschaften hat den Chemie-Nobelpreise 2014 drei Wissenschaftlern für ihre Entwicklungen in der Fluoreszenz-Mikroskopie zugesprochen, mit denen das Abbésche Beugungslimit umgangen werden kann und die Struktur von Objekten im Nanometer-Bereich aufgeklärt werden kann. Ausgezeichnet wurden Stefan W. Hell für die Entwicklung des STED-Mikroskopes (STimulated Emission Depletion) sowie Eric Betzig und William E. Moerner für ihre grundlegenden Arbeiten, die zu einem Ein-Molekül-Mikroskop führten.

Laser löscht Fluoreszenz aus

Ein STED-Mikroskop regt die Probe mit Laserlicht niedriger Intensität zur Fluoreszenz an; dabei ist der Bereich der Anregung gegeben durch das Beugungslimit. Das intensive Licht eines zweiten Lasers, dessen Frequenz zu niedrigeren Wellenlängen verschoben ist und dessen Intensität im Fokalpunkt des ersten Lasers gegen Null geht, bringt die vom ersten Laser angeregten Elektronen durch den Mechanismus der stimulierten Emission in einen über dem Grundzustand liegenden elektronischen Zustand; die bei diesem Übergang abgestrahlte Energie des Photons liegt unter der des Fluoreszenz-Übergangs und wird beim Nachweis im STED-Mi­kro­skop unterdrückt. In dieser Anordnung wird der fluoreszierende Bereich der Probe kleiner, je höher die Intensität des zweiten Lasers ist, und lässt sich so auf einen Bereich beschränken, der deutlich kleiner ist als der, der durch das Abbésche Beugungslimit gegeben ist.

Um das vollständige Bild einer Struktur zu erhalten, scannt das STED-Mikroskop mit den beiden Laserlichtbündeln über die Probe. Unter der Voraussetzung, dass die fluoreszierenden Moleküle (Fluorophore) die Struktur der Probe definieren, entsteht so ein Bild der Probe, dessen Auflösung deutlich unter den 0,2 µm (halbe Lichtwellenlänge) liegt, die mit einem optischen Mikro­skop zu erreichen sind.
Das Ein-Molekül-Mikroskop beruht auf der Möglichkeit, die Fluoreszenz eines individuellen Moleküls ein- und ausschalten zu können. Um nun die Struktur einer Probe aufzuklären, wird der Bereich mehrfach aufgenommen; ­jedesmal werden dabei andere Moleküle zur Fluoreszenz angeregt; aus der Überlagerung der Einzelbilder ergibt sich dann ein Gesamtbild der Struktur mit einer Auflösung im Nanometerbereich. Die sogenannte „Super-resolved single fluorophore microscopy“ macht Gebrauch von der Erkenntnis, dass nahezu alle Photonen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt von einem Objekt ausgehen, von einzelnen fluoreszierenden Molekülen – den Fluorophoren – herrühren, deren Abstand untereinander größer ist als das Abbésche Beugungslimit.Die Entwicklung der Ein-Molekül-Mikroskopie verlief dabei in drei Etappen: die Entdeckung einzelner Fluorophore in dichten Me­dien (1), die theoretische Beschreibung (2) und die experimentelle Implementierung der Methode (3). Dabei konnte Moerner im Jahre 1989 mit Hilfe der Absorptionsspektroskopie zum ersten Mal einzelne Fluorophore in dichten Medien nachweisen. Die daran anschließenden Arbeiten verschiedenster ­Arbeitsgruppen legten den Grundstein für die beiden nunmehr mit dem ­Nobelpreis ausgezeichneten Methoden: Mikroskopie mit Fluorophoren aus dem Ensemble (STED) und einzelnen Molekülen. Eric Betzig schließlich hatte die Idee, wie sich die Auflösung in der Ein-Molekül-Mikroskopie verbessern ließe: Durch die Verwendung von Molekülen, die Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen emittierten. Durch die Überlagerung der bei verschiedenen Wellenlängen aufgenommenen Bilder ließe sich die Position der Fluorophore mit einer Genauigkeit unterhalb des Abbéschen Limits bestimmen. Zehn Jahre später stieß er per Zufall auf ein fluoreszierendes Molekül, das sich willkürlich aktivieren ließ. Damit mussten die Moleküle nicht mehr in unterschiedlichen Wellenlängen emittieren; es genügte, sie in zeitlichen Abständen ein- und auszuschalten. Bereits ein Jahr später konnte er zeigen, dass sich diese Idee in die praktische Anwendung umsetzen ließ.

Im Inneren lebender Strukturen

Die von Eric Betzig, Stefan Hell und W. E. Moerner entwickelten Methoden der Nanoskopie werden heute in den Laboratorien weltweit verwendet. Auch die drei Nobelpreisträger sind aktive Forscher in einer wachsenden Community von Wissenschaftlern: Stefan Hell etwa hat mit seiner Methode die Struktur von Nervenzellen erforscht, W. E. Moerner sich mit dem Einfluss von Proteinen auf die Huntington-Krankheit beschäftigt und Eric Betzig die Zellteilung in Em­bryos untersucht.